GABARAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416746-ACT

GABARAP (proteina associata al recettore GABA di tipo A) è un membro della famiglia ATG8, simile all’ubiquitina, che regola l’autofagia promuovendo la maturazione degli autofagosomi, il reclutamento del carico e la fusione con i lisosomi attraverso interazioni con proteine contenenti la regione di interazione con LC3 (LIR). Contribuisce inoltre al traffico intracellulare delle membrane e al clustering dei recettori, collegando il flusso autofagico al trasporto vescicolare e all’organizzazione del citoscheletro. La disregolazione delle vie associate a GABARAP è rilevante per gli squilibri della proteostasi, i processi neurodegenerativi e l’adattamento delle cellule tumorali allo stress, in cui un’autofagia alterata può influenzare i segnali di sopravvivenza e il rimodellamento metabolico. In quanto proteina “scaffold” compatta con numerosi partner di legame, GABARAP è spesso studiata per analizzare i meccanismi dell’autofagia selettiva e il controllo di qualità degli organelli.

GABARAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GABARAP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GABARAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GABARAP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GABARAP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GABARAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GABARAP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GABARAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GABARAP nelle cellule tumorali con espressione di GABARAP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.