G9a Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402484-ACT

EHMT2 codifica la metiltransferasi umana della lisina degli istoni G9a, uno dei principali “writer” dei segni H3K9me1/2, che promuovono l’eterocromatina facoltativa e la repressione trascrizionale. G9a coopera con GLP, con le proteine HP1 e con il macchinario di metilazione del DNA per modulare l’accessibilità della cromatina e stabilizzare programmi di espressione genica specifici di linea durante lo sviluppo e la differenziazione. Attraverso la regolazione del controllo del ciclo cellulare, delle risposte al danno al DNA e di reti trascrizionali metaboliche e infiammatorie, EHMT2 influenza molteplici vie di segnalazione legate all’omeostasi epigenetica. Un’attività deregolata di G9a e pattern alterati di metilazione di H3K9 sono stati associati alla biologia tumorale, a fenotipi di neurosviluppo e a rimodellamenti trascrizionali correlati al sistema immunitario, a supporto della sua rilevanza nella modellizzazione meccanicistica delle malattie.

G9a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EHMT2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

G9a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EHMT2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EHMT2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di G9a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EHMT2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da G9a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via G9a nelle cellule tumorali con espressione di EHMT2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.