G6PD Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420446-ACT

Il gene murino **G6pdx** codifica la glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD), l’enzima limitante della velocità del ramo ossidativo della via del pentoso fosfato, che converte il glucosio-6-fosfato in 6-fosfogluconolattone generando al contempo NADPH. Il NADPH sostiene le difese antiossidanti dipendenti dal glutatione, l’omeostasi redox e programmi biosintetici che includono la sintesi di lipidi e nucleotidi, influenzando così la proliferazione e le risposte cellulari allo stress. L’attività di G6PD si intreccia con la rimodulazione metabolica durante l’attivazione immunitaria e con il tamponamento delle specie reattive dell’ossigeno mitocondriali, collegandola a vie che regolano l’infiammazione, la suscettibilità alla ferroptosi e la proteostasi. L’alterazione dell’espressione o dell’attività di G6PD è ampiamente utilizzata come modello per studiare fenotipi legati allo stress ossidativo e vulnerabilità metaboliche rilevanti per difetti redox di tipo anemico e per contesti cardiometabolici e neuroinfiammatori.

G6PD Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di G6pdx senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

G6PD Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus G6pdx nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione G6pdx, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di G6PD. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus G6pdx nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da G6PD nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via G6PD nelle cellule tumorali con espressione di G6pdx silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.