FUS/TLS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400612-ACT

FUS (FUS/TLS) codifica una proteina legante RNA/DNA che coordina molteplici fasi dell’espressione genica, inclusi la regolazione trascrizionale, lo splicing del pre‑mRNA, il trasporto dell’mRNA e la biogenesi dei microRNA. FUS partecipa alla risposta al danno del DNA e al mantenimento del genoma tramite interazioni con fattori di riparazione e l’accoppiamento tra trascrizione e processamento dell’RNA, e si ridistribuisce dinamicamente nei granuli di stress in condizioni di stress cellulare. Attraverso questi ruoli, FUS influenza l’omeostasi neuronale e le vie della proteostasi, nelle quali un controllo preciso del metabolismo dell’RNA è fondamentale. La disregolazione, l’aggregazione o la mutazione di FUS sono fortemente associate alla biologia delle malattie neurodegenerative, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica e la degenerazione lobare frontotemporale, rendendola un modello ampiamente utilizzato per lo studio delle proteinopatie da proteine leganti l’RNA.

FUS/TLS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FUS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FUS/TLS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FUS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FUS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FUS/TLS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FUS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FUS/TLS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FUS/TLS nelle cellule tumorali con espressione di FUS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.