fumarate hydratase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401660-ACT

Il gene umano **FH** codifica la fumarato idratasi (fumarasi), un enzima omotetramerico del ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA) che catalizza l’idratazione reversibile del fumarato a L-malato, collegando il metabolismo energetico mitocondriale all’anaplerosi e all’omeostasi redox. Oltre al flusso centrale del carbonio, i livelli di fumarato influenzano la segnalazione cellulare attraverso la succinazione delle proteine e la modulazione di programmi epigenetici e associati all’ipossia, mettendo in relazione l’attività di FH con le risposte allo stress mitocondriale e la riprogrammazione metabolica. L’alterazione della funzione di FH è stata associata a un metabolismo oncogenico e a una gestione modificata delle specie reattive dell’ossigeno, rendendo FH un nodo chiave per studiare la disfunzione mitocondriale, i checkpoint metabolici e le relazioni genoma-metabolita nelle cellule umane.

fumarate hydratase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

fumarate hydratase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di fumarate hydratase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da fumarate hydratase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via fumarate hydratase nelle cellule tumorali con espressione di FH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.