Flk-1/KDR/VEGFR2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400118-ACT

KDR codifica la tirosin-chinasi recettoriale VEGFR2 (Flk-1/KDR), un nodo di segnalazione principale per le risposte dell’endotelio vascolare guidate dal VEGF. In seguito al legame del ligando e all’autofosforilazione del recettore, VEGFR2 attiva le cascate PI3K–AKT, PLCγ–PKC–MAPK/ERK, Src/FAK e quelle collegate a eNOS, che coordinano proliferazione, migrazione, sopravvivenza e permeabilità endoteliali. Questa via è centrale nei programmi angiogenici e linfangiogenici ed è spesso studiata in contesti di neovascolarizzazione tumorale, rimodellamento associato all’ischemia e disfunzione vascolare infiammatoria. Una segnalazione KDR disregolata è stata associata a un’alterata integrità del microcircolo e a interazioni endotelio–periciti aberranti, rilevanti per la biologia delle malattie cardiovascolari e oculari.

Flk-1/KDR/VEGFR2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KDR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Flk-1/KDR/VEGFR2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KDR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KDR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Flk-1/KDR/VEGFR2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KDR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Flk-1/KDR/VEGFR2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Flk-1/KDR/VEGFR2 nelle cellule tumorali con espressione di KDR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.