FLASH Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403170-ACT

CASP8AP2 codifica FLASH, una grande proteina nucleare che coordina la segnalazione associata all’apoptosi e il processamento dell’RNA. FLASH è implicata nella modulazione della via della caspasi-8 collegata ai recettori di morte e svolge un ruolo nel processamento dell’estremità 3′ dell’mRNA degli istoni attraverso interazioni con lo snRNP U7 e con l’histone locus body, collegando la progressione del ciclo cellulare ai programmi della cromatina e della trascrizione. Influenzando la biogenesi degli istoni accoppiata alla fase S, la stabilità del genoma e le risposte allo stress, FLASH è stata studiata in contesti di proliferazione deregolata e di soglie apoptotiche alterate. Alterazioni dell’attività o dell’espressione di CASP8AP2/FLASH sono state associate alla biologia dei tumori e ai meccanismi delle malattie ematologiche, supportandone l’impiego come bersaglio per l’analisi di vie di segnalazione in modelli cellulari umani.

FLASH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CASP8AP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FLASH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CASP8AP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CASP8AP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FLASH. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CASP8AP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FLASH nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FLASH nelle cellule tumorali con espressione di CASP8AP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.