FIH-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402511-ACT

HIF1AN codifica o fator inibidor de HIF-1 (FIH-1), uma hidroxilase de asparagina dependente de Fe(II)/2-oxoglutarato que atenua a transcrição induzida por hipóxia ao hidroxilar o HIF-1α e limitar o recrutamento de coativadores (CBP/p300). Por meio desse ponto de controle pós-traducional, o FIH-1 integra a detecção de oxigênio com a reprogramação metabólica, a sinalização angiogênica e a homeostase redox dentro da via de HIF. O FIH-1 também modifica proteínas que contêm repetições de anquirina, conectando a disponibilidade de oxigênio a redes transcricionais e de sinalização mais amplas. A desregulação da sinalização de HIF e alterações na atividade de HIF1AN têm sido associadas a fenótipos impulsionados por hipóxia relevantes para a biologia do câncer, isquemia, inflamação e mecanismos de doenças metabólicas.

FIH-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HIF1AN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FIH-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HIF1AN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HIF1AN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FIH-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HIF1AN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FIH-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FIH-1 em células tumorais com expressão de HIF1AN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.