FIG4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-430460-ACT

Il gene murino **Fig4** codifica **FIG4**, una 5-fosfatasi dei fosfoinositidi di tipo SAC che controlla l’omeostasi del **fosfatidilinositolo 3,5-bisfosfato** sulle membrane endolisosomiali. Attraverso la sua funzione nel complesso regolatorio **PIKfyve/VAC14/FIG4**, FIG4 sostiene la maturazione degli endosomi, la funzione dei lisosomi, il traffico di membrana e l’autofagia, con effetti a valle sul mantenimento neuronale e sulla biologia della mielina. L’alterazione della segnalazione dei fosfoinositidi dipendente da FIG4 perturba la dinamica endolisosomiale ed è stata associata, in studi genetici, a fenotipi neurodegenerativi e neuromuscolari, rendendo **Fig4** un locus utile per modellare, nel sistema murino, lo stress cellulare guidato da difetti di traffico.

FIG4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Fig4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FIG4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Fig4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Fig4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FIG4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Fig4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FIG4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FIG4 nelle cellule tumorali con espressione di Fig4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.