Fibulin-3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-432105-ACT

Efemp1 codifica la fibulina-3, una glicoproteina della matrice extracellulare che si integra nelle microfibrille associate alle fibre elastiche e modula l’assemblaggio e la stabilità della matrice. Nei tessuti murini, la fibulina-3 influenza l’adesione cellula–matrice, la migrazione e il rimodellamento tissutale, plasmando l’organizzazione della matrice extracellulare e l’attività delle proteasi, con effetti a valle su vie legate a fibrosi, angiogenesi e segnalazione infiammatoria. Livelli alterati di fibulina-3 sono stati associati a fenotipi del tessuto connettivo e della retina e vengono spesso studiati nel contesto della disregolazione della matrice, incluso il rimodellamento del microambiente tumorale e i processi degenerativi legati all’età. Efemp1 rappresenta quindi un locus maneggevole per indagare come la composizione della matrice extracellulare controlli la meccanobiologia e i programmi di risposta allo stress.

Fibulin-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Efemp1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Fibulin-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Efemp1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Efemp1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Fibulin-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Efemp1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Fibulin-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Fibulin-3 nelle cellule tumorali con espressione di Efemp1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.