fibrillin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401449-ACT

FBN1 codifica per la fibrillina-1, una grande glicoproteina della matrice extracellulare che si assembla in microfibrille, fornendo supporto strutturale ed elasticità ai tessuti connettivi. La fibrillina-1 funge da impalcatura per la formazione delle fibre elastiche e regola la biodisponibilità dei fattori di crescita, in particolare la segnalazione TGF-β e BMP, sequestrando nella matrice i complessi latenti. Attraverso questi ruoli, influenza la meccanotrasduzione, le interazioni cellula–matrice e l’omeostasi tissutale nel sistema vascolare, nel polmone, nella pelle e nell’apparato muscoloscheletrico. Un’espressione alterata di FBN1 o un’alterazione dell’integrità delle microfibrille è associata a disordini ereditari del tessuto connettivo e a una deregolazione dell’attività della via del TGF-β, rilevante per fenotipi cardiovascolari e scheletrici.

fibrillin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FBN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

fibrillin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FBN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FBN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di fibrillin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FBN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da fibrillin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via fibrillin-1 nelle cellule tumorali con espressione di FBN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.