Fhit Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404220-ACT

FHIT codifica Fhit, una proteina legante nucleotidi della famiglia histidine triad (HIT), spesso associata al mantenimento dell’integrità del genoma e alle risposte allo stress cellulare. Fhit partecipa a processi di segnalazione che influenzano la sorveglianza del danno al DNA, lo stress da replicazione e le vie apoptotiche, e la sua attività è stata collegata alla regolazione della proliferazione e della trasformazione cellulare. In quanto locus all’interno di un sito fragile comune, FHIT viene spesso studiato nel contesto dell’instabilità genomica e dei pattern di espressione alterati osservati in diversi modelli derivati da tumori. Queste caratteristiche rendono FHIT un bersaglio utile per analizzare i percorsi che collegano il metabolismo dei nucleotidi e la segnalazione da stress al controllo del ciclo cellulare.

Fhit Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FHIT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Fhit Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FHIT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FHIT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Fhit. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FHIT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Fhit nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Fhit nelle cellule tumorali con espressione di FHIT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.