FBL19 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407318-ACT

FBXL19 (FBL19) codifica una proteina F-box che funge da componente di riconoscimento del substrato dei complessi E3 ubiquitina ligasi SCF (SKP1–CUL1–F-box), collegando specifiche proteine al turnover dipendente dall’ubiquitina. Attraverso una proteostasi regolata, FBXL19 contribuisce al controllo delle transizioni dello stato cellulare e dei programmi trascrizionali, con ruoli riportati in processi associati alla cromatina e nella regolazione genica dipendente dalla segnalazione. Nell’ambito delle vie del sistema ubiquitina–proteasoma, un’alterata attività di FBXL19 può perturbare l’omeostasi proteica e le reti a valle che governano proliferazione, differenziamento e risposte allo stress. La disregolazione delle ubiquitina ligasi, incluse le proteine F-box, è frequentemente associata alla biologia dei tumori e a fenotipi dello sviluppo, rendendo FBXL19 un nodo rilevante per studi meccanicistici.

FBL19 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FBXL19 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FBL19 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FBXL19 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FBXL19, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FBL19. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FBXL19 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FBL19 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FBL19 nelle cellule tumorali con espressione di FBXL19 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.