FANCD2 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-400445-LAC

FANCD2 codifica un effettore centrale della via di riparazione dei legami crociati interfilamento del DNA (ICL) dell’anemia di Fanconi (FA) e coordina il mantenimento del genoma durante la fase S. In seguito a stress replicativo o a danno da legami crociati, FANCD2 viene monoubiquitinata e si accumula alle forcelle di replicazione bloccate, dove funge da piattaforma per la riparazione insieme a partner tra cui FANCI, BRCA1/2, RAD51 e nucleasi che processano le lesioni del DNA. Questa attività si interfaccia con la ricombinazione omologa, la segnalazione dei checkpoint e la protezione delle forcelle di replicazione, collegando la funzione di FANCD2 alla stabilità cromosomica e alla progressione del ciclo cellulare. Difetti nella riparazione mediata da FANCD2 sono associati ai fenotipi dell’anemia di Fanconi e a una maggiore sensibilità agli agenti che inducono legami crociati, rendendo questa via un obiettivo chiave negli studi sulle risposte al danno del DNA e sull’instabilità genomica associata al cancro.

Le particelle di attivazione lentivirale FANCD2 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di FANCD2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale FANCD2 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione FANCD2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di FANCD2. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo FANCD2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.