FANCB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417439-ACT

FANCB codifica un componente centrale della via di riparazione del DNA dell’anemia di Fanconi (FA), che salvaguarda l’integrità del genoma durante la fase S promuovendo la riparazione dei crosslink interfilamento del DNA. All’interno del complesso core FA, FANCB sostiene l’assemblaggio e l’attività del modulo E3 ubiquitina ligasi che monoubiquitina FANCD2 e FANCI, consentendo il coordinamento a valle con la ricombinazione omologa e con i meccanismi di protezione delle forcelle di replicazione. L’alterazione o la disfunzione di FANCB compromette la rete FA/BRCA, aumentando lo stress replicativo, l’instabilità cromosomica e la sensibilità ai danni da agenti crosslinkanti. Varianti patogene di FANCB sono associate all’anemia di Fanconi e a fenotipi correlati di sviluppo e di insufficienza del midollo osseo, rendendo la regolazione di FANCB uno strumento utile per studiare le risposte al danno del DNA.

FANCB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FANCB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FANCB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FANCB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FANCB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FANCB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FANCB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FANCB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FANCB nelle cellule tumorali con espressione di FANCB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.