FAM20C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406736-ACT

FAM20C codifica una chinasi secreta localizzata nell’apparato di Golgi che fosforila motivi Ser-x-Glu/pSer su numerose proteine extracellulari e secrete, inclusi membri della famiglia SIBLING e altri fattori associati alla matrice. Attraverso la regolazione della fosforilazione proteica nella via secretoria, FAM20C influenza l’organizzazione della matrice extracellulare, la biomineralizzazione e la segnalazione cellula–matrice, con effetti a valle sulla differenziazione osteogenica e sull’omeostasi tissutale. Alterazioni dell’attività di FAM20C e la deregolazione dei fosfoproteomi secreti sono state collegate a difetti dello sviluppo scheletrico e dentale e a fenotipi più ampi del tessuto connettivo, rendendolo un nodo chiave per lo studio della biologia della matrice. Il suo ruolo nelle modifiche post-traduzionali dipendenti dal Golgi collega inoltre FAM20C a vie che controllano la secrezione, il controllo qualità delle proteine e la segnalazione intercellulare attraverso il microambiente extracellulare.

FAM20C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FAM20C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FAM20C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FAM20C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FAM20C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FAM20C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FAM20C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FAM20C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FAM20C nelle cellule tumorali con espressione di FAM20C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.