EXT1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404635-ACT

L’EXT1 umano codifica l’exostosina-1, una glicosiltransferasi residente nel Golgi che forma un complesso funzionale con EXT2 per catalizzare l’allungamento delle catene di eparan solfato sui proteoglicani. Controllando la biosintesi dell’eparan solfato, EXT1 contribuisce all’organizzazione della matrice extracellulare e modula la disponibilità dei ligandi per importanti vie di segnalazione, tra cui FGF, WNT, Hedgehog e BMP, influenzando adesione cellulare, migrazione e patterning dello sviluppo. L’alterazione o la disregolazione di EXT1 modifica la composizione dei proteoglicani e i gradienti di segnalazione ed è fortemente associata a displasie scheletriche, come le osteocondromi multiple, e più in generale a difetti della morfogenesi tissutale. L’attività di EXT1 è rilevante anche negli studi sul rimodellamento del microambiente tumorale e sulle interazioni recettore–ligando che dipendono dalla presentazione dell’eparan solfato.

EXT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EXT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EXT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EXT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EXT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EXT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EXT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EXT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EXT1 nelle cellule tumorali con espressione di EXT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.