Plasmide CRISPR d'Activation (h) EXOSC3: sc-403842-ACT

L’EXOSC3 humain code une sous-unité centrale de la coiffe du cœur de l’exosome à ARN, un complexe multiprotéique essentiel qui assure le traitement et la dégradation exonucléolytique des ARN dans le sens 3′→5′, à la fois dans le noyau et dans le cytoplasme. EXOSC3 participe aux voies de contrôle qualité des ARN qui régulent la maturation des ARNr, des ARNsn/ARNsno, ainsi que le renouvellement de divers ARN non codants et ARN messagers, influençant ainsi la biogenèse des ribosomes et la surveillance des ARN. Toute perturbation de l’intégrité de l’exosome peut modifier l’homéostasie du transcriptome et les réponses au stress, reliant la biologie d’EXOSC3 à des mécanismes impliqués dans des phénotypes neurodéveloppementaux et neurodégénératifs. En tant que composant conservé de l’exosome, EXOSC3 est fréquemment étudié afin de comprendre comment le métabolisme des ARN façonne la différenciation cellulaire et la protéostasie.

EXOSC3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EXOSC3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EXOSC3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EXOSC3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EXOSC3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EXOSC3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EXOSC3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EXOSC3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EXOSC3 dans les cellules tumorales présentant une expression de EXOSC3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.