ESET Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401325-ACT

SETDB1 umano codifica ESET, una metiltransferasi delle lisine istoniche contenente il dominio SET che deposita i segni repressivi H3K9me3 per promuovere la formazione di eterocromatina e il silenziamento genico stabile. ESET svolge un ruolo nella regolazione epigenetica della trascrizione, nella soppressione dei retroelementi endogeni e nel mantenimento dell’integrità del genoma attraverso interazioni con corepressori e complessi di rimodellamento della cromatina. Modellando programmi trascrizionali specifici di linea cellulare, SETDB1 influenza la pluripotenza, la differenziazione e gli stati della cromatina associati al ciclo cellulare. Un’attività deregolata di SETDB1 e paesaggi alterati di metilazione di H3K9 sono frequentemente studiati nel contesto della riprogrammazione trascrizionale oncogenica e di fenotipi di evasione immunitaria, oltre che della più generale instabilità dell’epigenoma in modelli di malattia umana.

ESET Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SETDB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ESET Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SETDB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SETDB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ESET. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SETDB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ESET nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ESET nelle cellule tumorali con espressione di SETDB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.