ERp72 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402689-ACT

Il gene umano PDIA4 codifica ERp72, un’isomerasi dei ponti disolfuro del reticolo endoplasmatico (RE) che catalizza lo scambio tiolo–disolfuro a supporto del ripiegamento ossidativo e del controllo qualità delle proteine nascenti secretorie e di membrana. ERp72 opera all’interno della rete di proteostasi del RE insieme a chaperoni e ad altre PDI, contribuendo alla degradazione associata al RE (ERAD) e tamponando le perturbazioni che innescano la risposta alle proteine mal ripiegate (UPR). Attraverso queste attività, PDIA4 influenza l’omeostasi redox, i processi legati alla presentazione dell’antigene e la capacità secretoria in cellule altamente secernenti o sottoposte a stress. La deregolazione della proteostasi del RE e dell’attività delle PDI è spesso associata a segnali infiammatori, stress metabolico e adattamento delle cellule tumorali, rendendo PDIA4 un nodo utile per analizzare la biologia delle risposte allo stress.

ERp72 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PDIA4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ERp72 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PDIA4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PDIA4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ERp72. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PDIA4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ERp72 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ERp72 nelle cellule tumorali con espressione di PDIA4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.