ERp57 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401497-ACT

PDIA3 codifica ERp57, un’isomerasi/disolfuro isomerasi del reticolo endoplasmatico (RE) che coopera con calnexina e calreticulina per catalizzare la formazione e l’isomerizzazione dei ponti disolfuro durante il ripiegamento delle glicoproteine. ERp57 contribuisce alla proteostasi del RE, al controllo qualità e a processi associati al RE legati alla risposta alle proteine non ripiegate (unfolded protein response, UPR) e al ripiegamento ossidativo delle proteine. Al di fuori del lume del RE, PDIA3 è stata implicata nella presentazione dell’antigene attraverso il caricamento dei peptidi su MHC di classe I e, più in generale, nella regolazione della segnalazione cellulare da stress. Un’attività o un’espressione deregolata di ERp57 è associata ad alterazioni dell’omeostasi proteica ed è stata studiata nel contesto di infiammazione, neurodegenerazione e vie correlate al cancro.

ERp57 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PDIA3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ERp57 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PDIA3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PDIA3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ERp57. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PDIA3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ERp57 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ERp57 nelle cellule tumorali con espressione di PDIA3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.