ERM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401161-ACT

L’ETV5 umano codifica il fattore di trascrizione della famiglia ETS ERM, un regolatore di legame al DNA a specificità di sequenza che integra segnali extracellulari per controllare programmi genici che governano proliferazione, differenziamento e migrazione cellulare. ERM agisce a valle della segnalazione mediata da recettori tirosin-chinasici, incluse le vie FGF–MAPK/ERK, e contribuisce alla specificazione di linea cellulare e al rimodellamento tissutale tramite il controllo trascrizionale di stati di sviluppo e di tipo staminale. Un’attività deregolata di ETV5/ERM è stata associata ad alterazioni del differenziamento epiteliale ed endocrino ed è spesso collegata a reti trascrizionali oncogeniche in molteplici contesti tumorali. Queste proprietà rendono ETV5 un nodo utile per studiare i circuiti trascrizionali guidati dagli ETS, l’utilizzo di enhancer dipendente dal segnale e la regolazione genica specifica del contesto in modelli cellulari umani.

ERM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ETV5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ERM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ETV5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ETV5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ERM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ETV5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ERM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ERM nelle cellule tumorali con espressione di ETV5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.