ERCC1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400630-ACT

ERCC1 codifica un’endonucleasi specifica per la struttura che forma un eterodimero funzionale con XPF (ERCC4) per eseguire le fasi di incisione durante la riparazione per escissione di nucleotidi (NER) e per risolvere i legami crociati interfilamento del DNA in coordinamento con la via dell’anemia di Fanconi. Attraverso queste attività, ERCC1 contribuisce a mantenere la stabilità del genoma, favorisce il recupero della forcella di replicazione e limita l’accumulo di lesioni del DNA causate dalla luce ultravioletta e da agenti genotossici. Un’alterazione della funzione o dell’espressione di ERCC1 è associata a una ridotta capacità di riparazione del DNA, a un aumento del carico mutazionale e a ipersensibilità cellulare allo stress da danno al DNA. I processi di riparazione dipendenti da ERCC1 sono quindi ampiamente studiati in contesti quali la carcinogenesi, il mantenimento del genoma legato all’invecchiamento e i meccanismi di resistenza o suscettibilità al danno al DNA in sistemi sperimentali.

ERCC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ERCC1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ERCC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ERCC1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ERCC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ERCC1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ERCC1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ERCC1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ERCC1 nelle cellule tumorali con espressione di ERCC1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.