ephrin-A5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402127-ACT

EFNA5 codifica per ephrin-A5, un ligando ancorato alla glicosilfosfatidilinositolo (GPI) per le tirosin-chinasi recettoriali EphA, che media una segnalazione dipendente dal contatto sulla superficie cellulare. Le interazioni ephrin-A5–EphA coordinano la guida degli assoni, la formazione delle sinapsi e la definizione dei confini tissutali regolando la dinamica del citoscheletro, l’adesione cellulare e segnali di migrazione repulsivi/attrattivi attraverso vie quali le GTPasi della famiglia Rho, MAPK/ERK e la segnalazione PI3K. In contesti non neuronali, EFNA5 contribuisce a comportamenti epitelio-mesenchimali, al patterning vascolare e alla modulazione del microambiente tumorale tramite la segnalazione bidirezionale Eph/ephrin. Un’attività deregolata della via Eph/ephrin, inclusa un’alterata espressione di EFNA5, è stata associata a motilità cellulare e invasività aberranti in modelli di cancro e a fenotipi neuroevolutivi rilevanti per l’assemblaggio dei circuiti neurali.

ephrin-A5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EFNA5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ephrin-A5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EFNA5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EFNA5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ephrin-A5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EFNA5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ephrin-A5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ephrin-A5 nelle cellule tumorali con espressione di EFNA5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.