ephrin-A3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402771-ACT

EFNA3 codifica per ephrin-A3, un ligando ancorato al glicosilfosfatidilinositolo (GPI) per le tirosin-chinasi recettoriali EphA che media la comunicazione cellula-cellula dipendente dal contatto. La segnalazione ephrin-A3/EphA regola il rimodellamento del citoscheletro, l’adesione cellulare e la migrazione direzionale, influenzando la formazione dei confini tissutali, la guida assonale e il patterning vascolare attraverso vie che includono le GTPasi della famiglia Rho e programmi dipendenti da MAPK. Nei sistemi dei mammiferi, alterazioni della segnalazione ephrin–Eph sono state associate a cambiamenti nella connettività neuronale, nel rimodellamento angiogenico e in fenotipi invasivi in molteplici contesti patologici, rendendo EFNA3 un nodo utile per lo studio della segnalazione del microambiente. L’attività di EFNA3 nell’uomo è quindi rilevante per chiarire come segnali ancorati alla membrana plasmatica plasmino differenziamento, motilità e organizzazione dei tessuti.

ephrin-A3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EFNA3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ephrin-A3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EFNA3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EFNA3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ephrin-A3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EFNA3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ephrin-A3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ephrin-A3 nelle cellule tumorali con espressione di EFNA3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.