ephrin-A2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403672-ACT

EFNA2 codifica l’efrina-A2, un ligando di membrana ancorato tramite glicosilfosfatidilinositolo (GPI) per le tirosin-chinasi recettoriali Eph, che media una segnalazione dipendente dal contatto nella comunicazione cellula-cellula. La segnalazione Eph/efrina regola la guida assonale, l’assemblaggio dei circuiti neuronali, il patterning vascolare, la formazione dei confini epiteliali e la migrazione cellulare attraverso vie che interagiscono con le GTPasi della famiglia Rho, la segnalazione MAPK e il rimodellamento del citoscheletro. Un’espressione alterata di EFNA2 o uno sbilanciamento della segnalazione EphA–efrina-A sono stati associati a fenotipi di adesione e motilità deregolati, rilevanti per i processi di neurosviluppo e per la biologia del cancro, inclusi l’invasione tumorale e il rimodellamento angiogenico. In quanto segnale ancorato alla superficie, l’efrina-A2 è utile anche per studiare la segnalazione bidirezionale, in cui cellule che esprimono il ligando e cellule che esprimono il recettore innescano risposte downstream distinte.

ephrin-A2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EFNA2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ephrin-A2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EFNA2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EFNA2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ephrin-A2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EFNA2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ephrin-A2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ephrin-A2 nelle cellule tumorali con espressione di EFNA2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.