EphA5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403104-ACT

EPHA5 codifica il recettore dell’efrina di tipo A 5 (EphA5), una tirosin-chinasi recettoriale che media una segnalazione dipendente dal contatto attraverso il legame con ligandi ephrin-A ancorati alla membrana. EphA5 regola la guida assonale, la formazione delle sinapsi e l’affinamento dei circuiti neuronali coordinando il rimodellamento del citoscheletro, l’adesione cellulare e programmi direzionali di repulsione/attrazione cellulare. La segnalazione a valle interseca le GTPasi della famiglia Rho, le vie MAPK e reti di chinasi/fosfatasi che controllano la crescita dei neuriti e la migrazione cellulare. Una deregolazione della segnalazione Eph/ephrin è stata implicata in fenotipi del neurosviluppo e neuropsichiatrici, nonché in un comportamento invasivo alterato e in un rimodellamento delle vie di segnalazione in contesti correlati al cancro.

EphA5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EPHA5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EphA5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EPHA5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EPHA5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EphA5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EPHA5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EphA5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EphA5 nelle cellule tumorali con espressione di EPHA5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.