EphA2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400535-ACT

EPHA2 codifica EphA2, una tirosin-chinasi recettoriale della famiglia delle efrine che media una segnalazione dipendente dal contatto per coordinare la comunicazione cellula-cellula, il rimodellamento del citoscheletro e la formazione dei confini tissutali. In seguito al legame con ligandi ephrin-A, EphA2 modula cascate a valle che includono le GTPasi della famiglia Rho, MAPK/ERK, PI3K/AKT e la dinamica delle adesioni focali, plasmando i programmi di adesione, migrazione e proliferazione. In contesti epiteliali ed endoteliali, EphA2 contribuisce alla morfogenesi e all’organizzazione delle barriere, e la sua deregolazione è spesso studiata in relazione alla segnalazione oncogenica, a fenotipi associati all’invasione e a risposte angiogeniche alterate. In quanto recettore di superficie che integra segnali del microambiente, EPHA2 rappresenta un nodo accessibile per analizzare reti di segnalazione guidate dai recettori e il cross-talk tra vie a ridosso della membrana.

EphA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EPHA2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EphA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EPHA2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EPHA2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EphA2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EPHA2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EphA2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EphA2 nelle cellule tumorali con espressione di EPHA2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.