Plasmide CRISPR d'Activation (m) ENX-1: sc-420259-ACT

La souris Ezh2 code la méthyltransférase des lysines des histones ENX-1, sous-unité catalytique du complexe répressif Polycomb 2 (PRC2), qui dépose la marque H3K27me3 afin de maintenir des programmes de silenciation transcriptionnelle. ENX-1 régule la compaction de la chromatine, la spécification des lignages, la progression du cycle cellulaire et la répression de régulateurs du développement, en s’intégrant au contrôle épigénétique des enhancers et des promoteurs à travers les différents états de différenciation. L’activité dérégulée d’EZH2/PRC2 est largement étudiée en biologie du cancer, dans le maintien des cellules souches et la différenciation des cellules immunitaires, où des altérations de la méthylation de H3K27 peuvent reconfigurer les réseaux d’expression génique. Ezh2 constitue donc un nœud central pour étudier, dans des modèles murins, le contrôle de la prolifération, l’engagement du destin cellulaire et la plasticité transcriptionnelle médiés par la chromatine.

ENX-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ezh2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ENX-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ezh2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ezh2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ENX-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ezh2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ENX-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ENX-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ezh2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.