ENX-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420259-ACT

Ezh2 del topo codifica per la metiltransferasi istonica della lisina ENX-1, la subunità catalitica del complesso repressivo Polycomb 2 (PRC2), che deposita H3K27me3 per mantenere programmi di silenziamento trascrizionale. ENX-1 regola la compattazione della cromatina, la specificazione di linea, la progressione del ciclo cellulare e la repressione dei regolatori dello sviluppo, integrandosi con il controllo epigenetico di enhancer e promotori nei diversi stati di differenziamento. L’attività deregolata di EZH2/PRC2 è ampiamente studiata nella biologia del cancro, nel mantenimento delle cellule staminali e nella differenziazione delle cellule immunitarie, dove alterazioni della metilazione di H3K27 possono riconfigurare le reti di espressione genica. Ezh2 è quindi un nodo centrale per studiare, nei modelli murini, il controllo della proliferazione, dell’impegno di destino cellulare e della plasticità trascrizionale mediato dalla cromatina.

ENX-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ezh2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ENX-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ezh2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ezh2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ENX-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ezh2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ENX-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ENX-1 nelle cellule tumorali con espressione di Ezh2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.