Enterokinase HC Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403764-ACT

TMPRSS15 codifica l’enterokinasi, una serin-proteasi transmembrana di tipo II espressa sul bordo a spazzola del tratto prossimale dell’intestino tenue, dove avvia cascate proteolitiche digestive convertendo il tripsinogeno in tripsina. Questo passaggio di attivazione amplifica l’elaborazione a valle di molteplici zimogeni pancreatici, collegando TMPRSS15 alla segnalazione mediata da proteasi e alla digestione luminale delle proteine. Un’attività alterata dell’enterokinasi è associata a un assorbimento proteico compromesso e a disfunzione intestinale, e il gene è utilizzato come marcatore della differenziazione degli enterociti e della maturazione epiteliale. Poiché l’attivazione delle proteasi influenza la gestione dei nutrienti e l’omeostasi della mucosa, TMPRSS15 è rilevante negli studi di fisiologia gastrointestinale e di biologia della barriera epiteliale.

Enterokinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TMPRSS15 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Enterokinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TMPRSS15 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TMPRSS15, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Enterokinase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TMPRSS15 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Enterokinase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Enterokinase nelle cellule tumorali con espressione di TMPRSS15 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.