Enigma Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403254-ACT

Il gene umano PDLIM7 codifica Enigma, un adattatore con domini PDZ–LIM che si localizza nel citoscheletro di actina e in strutture associate alle adesioni focali, collegando complessi di segnalazione al rimodellamento del citoscheletro. Enigma partecipa ai programmi di meccanotrasduzione e motilità cellulare coordinando interazioni proteina–proteina all’interno delle reti di adesione e delle fibre da stress, influenzando vie che regolano l’architettura cellulare e la differenziazione. Grazie alle sue funzioni di scaffolding, PDLIM7 è stato studiato in contesti che riguardano l’organizzazione del muscolo cardiaco e scheletrico, in cui l’integrità del citoscheletro e la regolazione trascrizionale sono strettamente accoppiate. Un’espressione o una localizzazione deregolata di PDLIM7 è stata associata in letteratura a fenotipi di migrazione cellulare e rimodellamento tissutale alterati, rilevanti per la biologia cardiovascolare e oncogenica.

Enigma Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PDLIM7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Enigma Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PDLIM7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PDLIM7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Enigma. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PDLIM7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Enigma nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Enigma nelle cellule tumorali con espressione di PDLIM7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.