Endothelin-2/EDN2/ET-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403871-ACT

EDN2 codifica l’endotelina-2 (ET-2), un potente peptide vasoattivo processato a partire da un prepropeptide e che agisce principalmente tramite i recettori dell’endotelina (EDNRA/EDNRB) per regolare la contrazione della muscolatura liscia, la segnalazione endoteliale e il controllo paracrino della perfusione tissutale. La segnalazione di ET-2 attiva vie accoppiate a proteine G che modulano il calcio intracellulare, le cascate MAPK/ERK e PLC/PKC, influenzando proliferazione, migrazione e produzione di mediatori infiammatori. Oltre alla biologia vascolare, EDN2 è implicato nelle dinamiche riproduttive e dei follicoli ovarici, nei programmi trascrizionali responsivi all’ipossia e nel rimodellamento dello stroma. Un’attività deregolata dell’asse delle endotelina, inclusa un’espressione alterata di EDN2, è stata associata a processi fibrotici, a fisiopatologie polmonari e cardiovascolari e a segnali nel microambiente tumorale rilevanti per la biologia del cancro.

Endothelin-2/EDN2/ET-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EDN2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Endothelin-2/EDN2/ET-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EDN2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EDN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Endothelin-2/EDN2/ET-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EDN2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Endothelin-2/EDN2/ET-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Endothelin-2/EDN2/ET-2 nelle cellule tumorali con espressione di EDN2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.