Endothelin-1/EDN1/ET-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400564-ACT

EDN1 codifica l’endotelina-1 (ET-1), un potente peptide vasoattivo prodotto principalmente dalle cellule endoteliali e maturato a partire dalla preproendotelina fino a ET-1 nella sua forma matura. ET-1 segnala attraverso i recettori dell’endotelina (EDNRA/EDNRB) attivando vie accoppiate a proteine G che regolano i flussi di calcio, la segnalazione MAPK, il rimodellamento del citoscheletro e programmi trascrizionali che controllano la vasocostrizione, la proliferazione della muscolatura liscia vascolare e il turnover della matrice extracellulare. Oltre all’omeostasi cardiovascolare, EDN1 contribuisce alla segnalazione infiammatoria, alle risposte allo stress ossidativo e alla disfunzione endoteliale nei microambienti tissutali. L’espressione deregolata di EDN1 è spesso studiata nell’ipertensione polmonare e sistemica, nell’aterosclerosi, nelle malattie renali, nella fibrosi, nell’angiogenesi tumorale e in altri disturbi in cui sono centrali il rimodellamento vascolare e la segnalazione associata all’ipossia.

Endothelin-1/EDN1/ET-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EDN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Endothelin-1/EDN1/ET-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EDN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EDN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Endothelin-1/EDN1/ET-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EDN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Endothelin-1/EDN1/ET-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Endothelin-1/EDN1/ET-1 nelle cellule tumorali con espressione di EDN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.