EN2/Engrailed 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403598-ACT

EN2 (Engrailed 2) codifica un fattore di trascrizione homeobox che regola programmi di espressione genica deputati al neurosviluppo, alla regionalizzazione e alla differenziazione neuronale. EN2 influenza lo stato della cromatina e le reti trascrizionali coinvolte nella guida assonale, nell’organizzazione sinaptica e nella maturazione delle strutture del mesencefalo e del rombencefalo, integrandosi con vie di sviluppo quali la segnalazione WNT/β-catenina, SHH e FGF. Un’espressione deregolata di EN2 è stata associata ad alterazioni nella formazione dei circuiti neurali ed è stata studiata nel contesto di fenotipi neuroevolutivi e della biologia dei tumori cerebrali. In quanto regolatore legato alla linea cellulare e alla differenziazione, EN2 rappresenta un nodo utile per studiare il controllo trascrizionale dell’identità neurale, le transizioni di stato cellulare e le reti di geni bersaglio a valle in sistemi modello umani.

EN2/Engrailed 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EN2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EN2/Engrailed 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EN2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EN2/Engrailed 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EN2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EN2/Engrailed 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EN2/Engrailed 2 nelle cellule tumorali con espressione di EN2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.