EN1/Engrailed 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405900-ACT

EN1 (Engrailed 1) kodiert einen Homeobox-Transkriptionsfaktor, der während der embryonalen Entwicklung die Musterbildung und die Festlegung des Zellschicksals reguliert, mit wichtigen Funktionen in der Organisation des Mittelhirn–Hinterhirn-Grenzbereichs sowie in der neuronalen Differenzierung. Durch die Bindung an cis-regulatorische Elemente koordiniert EN1 Genexpressionsprogramme, die Morphogenese, Axonleitung und Linienerhalt formen, und ist in entwicklungsbiologische Signalnetzwerke eingebunden, darunter Wnt-, FGF- und Hedgehog-assoziierte transkriptionelle Outputs. In adulten Geweben und Krankheitsmodellen wurde eine veränderte EN1-Expression mit dysregulierten Differenzierungszuständen und aberranten transkriptionellen Schaltkreisen in Verbindung gebracht. Diese Eigenschaften machen EN1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung entwicklungsbiologischer Genregulationsnetzwerke und kontextabhängiger Transkriptionskontrolle in humanen Zellsystemen.

EN1/Engrailed 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EN1/Engrailed 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EN1/Engrailed 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EN1/Engrailed 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EN1/Engrailed 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.