EN1/Engrailed 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405900-ACT

EN1 (Engrailed 1) codifica un fattore di trascrizione homeobox che regola la definizione dei pattern e la specificazione del destino cellulare durante lo sviluppo embrionale, con ruoli di primo piano nell’organizzazione del mesencefalo–rombencefalo e nella differenziazione neuronale. Legandosi a elementi cis‑regolatori, EN1 coordina programmi di espressione genica che modellano la morfogenesi, la guida assonale e il mantenimento delle linee cellulari, interfacciandosi con reti di segnalazione dello sviluppo, inclusi gli output trascrizionali associati a Wnt, FGF e Hedgehog. Nei tessuti adulti e nei modelli di malattia, un’alterata espressione di EN1 è stata collegata a stati di differenziazione deregolati e a circuiti trascrizionali aberranti. Queste caratteristiche rendono EN1 un nodo utile per studiare le reti regolatorie geniche dello sviluppo e il controllo trascrizionale dipendente dal contesto in sistemi cellulari umani.

EN1/Engrailed 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EN1/Engrailed 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EN1/Engrailed 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EN1/Engrailed 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EN1/Engrailed 1 nelle cellule tumorali con espressione di EN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.