Emt Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402628-ACT

L’ITK umano codifica per la chinasi delle cellule T inducibile da IL-2, una tirosin-chinasi non recettoriale della famiglia Tec che collega l’ingaggio del recettore delle cellule T (TCR) alla segnalazione a valle necessaria per l’attivazione e la differenziazione dei linfociti. ITK partecipa alle vie prossimali del TCR che convergono sull’attivazione di PLCγ1, sul flusso di calcio, sulla segnalazione MAPK e su programmi trascrizionali che controllano la produzione di citochine e la funzione effettrice. Un’attività di ITK deregolata è associata a un’alterazione dell’equilibrio Th1/Th2, a un’immunità antivirale compromessa e a una linfoproliferazione anomala, rendendola rilevante per lo studio dell’omeostasi immunitaria e dei meccanismi delle malattie infiammatorie. Nel contesto della proteina Emt, ITK rappresenta un nodo gestibile per analizzare le dinamiche della trasduzione del segnale nelle cellule T umane e in linee ematopoietiche correlate.

Emt Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ITK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Emt Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ITK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ITK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Emt. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ITK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Emt nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Emt nelle cellule tumorali con espressione di ITK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.