Emi2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405054-ACT

FBXO43 codifica la proteina umana Emi2, un regolatore contenente un dominio F-box noto soprattutto per il controllo delle transizioni del ciclo cellulare tramite la modulazione dell’attività dell’APC/C e il conseguente turnover dei regolatori mitotici. Inibendo la funzione del complesso promotore dell’anafase fino a quando non vengono soddisfatti i corretti segnali del ciclo cellulare, Emi2 contribuisce alla progressione coordinata attraverso la fase M e al mantenimento dell’integrità genomica. Un’espressione o una regolazione alterata delle vie del ciclo cellulare legate al sistema ubiquitina–proteasoma che coinvolgono proteine F-box è frequentemente associata a fenotipi proliferativi e all’instabilità cromosomica osservati nella biologia dei tumori. FBXO43/Emi2 rappresenta quindi un punto di accesso meccanicistico per lo studio della proteolisi mediata da ubiquitina, del controllo dei checkpoint e della proliferazione deregolata in modelli cellulari umani.

Emi2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FBXO43 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Emi2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FBXO43 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FBXO43, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Emi2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FBXO43 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Emi2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Emi2 nelle cellule tumorali con espressione di FBXO43 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.