ELL Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404799-ACT

ELL umano codifica un fattore di elongazione della RNA polimerasi II che aumenta la processività della trascrizione e contribuisce a coordinare un’elongazione produttiva durante l’espressione genica. ELL partecipa a programmi di controllo trascrizionale che influenzano la progressione del ciclo cellulare, la differenziazione e le risposte cellulari allo stress attraverso la regolazione della pausa prossimale al promotore e dei checkpoint associati all’elongazione. La disregolazione dell’elongazione trascrizionale dipendente da ELL è collegata a un’alterata espressione di programmi di crescita e di linea cellulare, ed ELL è stato implicato in reti trascrizionali oncogeniche tramite eventi di fusione ricorrenti e il reclutamento aberrante di cofattori. Di conseguenza, ELL è spesso studiato per il suo ruolo nella fedeltà trascrizionale, nella regolazione associata alla cromatina e nel rimodellamento dell’espressione genica rilevante per la malattia.

ELL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ELL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ELL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ELL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ELL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ELL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ELL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ELL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ELL nelle cellule tumorali con espressione di ELL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.