eIF3α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404354-ACT

EIF3J codifica una subunità del complesso del fattore di inizio della traduzione eucariotica 3 (eIF3), un regolatore centrale dell’inizio della traduzione cap-dipendente che coordina il reclutamento della subunità ribosomiale 40S e la selezione del codone di inizio. Attraverso il suo ruolo nell’assemblaggio dei complessi di inizio e nella modulazione della traduzione specifica per mRNA, EIF3J influenza la proteostasi, la crescita cellulare e il controllo traduttivo adattativo allo stress. La disregolazione delle subunità di eIF3 è stata associata a programmi di traduzione alterati che sostengono la segnalazione oncogenica, la progressione del ciclo cellulare e le vie di sopravvivenza, rendendo EIF3J un utile punto di accesso per studiare meccanismi incentrati sulla traduzione in contesti rilevanti per la malattia. Lo studio della funzione di EIF3J può chiarire come la traduzione selettiva influenzi proliferazione, apoptosi e risposte allo stress da nutrienti e allo stress del reticolo endoplasmatico (RE).

eIF3α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EIF3J senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

eIF3α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EIF3J nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EIF3J, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di eIF3α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EIF3J nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da eIF3α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via eIF3α nelle cellule tumorali con espressione di EIF3J silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.