EF-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401163-ACT

L’EEF2 umano codifica il fattore di elongazione 2 (EF-2), un componente fondamentale del ciclo di elongazione della traduzione che catalizza la traslocazione del ribosoma lungo l’mRNA in modo dipendente dal GTP. L’attività di EF-2 è un determinante chiave della produzione del proteoma ed è regolata da vie di segnalazione legate a nutrienti e stress, tra cui mTOR e l’asse eEF2K, che coordinano la sintesi proteica con lo stato energetico della cellula. Alterazioni dell’espressione di EEF2 o della dinamica di fosforilazione di EF-2 possono modificare i programmi di controllo della traduzione, influenzando proliferazione, adattamento allo stress e rimodellamento metabolico. In quanto nodo centrale dell’omeostasi traduttiva, EEF2 è spesso studiato in contesti di segnalazione oncogenica, neurobiologia e risposte allo stress cellulare, in cui una sintesi proteica deregolata contribuisce a fenotipi associati alla malattia.

EF-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EEF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EF-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EEF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EEF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EF-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EEF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EF-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EF-2 nelle cellule tumorali con espressione di EEF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.