EDG-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402448-ACT

LPAR2 (EDG-4) codifica un recettore accoppiato a proteine G per l’acido lisofosfatidico (LPA) che si accoppia principalmente alla segnalazione Gi/Gq per regolare vie di secondi messaggeri che controllano il rimodellamento del citoscheletro, i flussi di calcio e i programmi trascrizionali. L’attivazione del recettore influenza le vie di segnalazione Rho/ROCK, PLC/PKC, PI3K–AKT e MAPK, collegando segnali lipidici extracellulari alla migrazione cellulare, alla sopravvivenza e alle risposte infiammatorie. Nelle cellule umane, l’attività di LPAR2 contribuisce a una regolazione dipendente dal contesto del comportamento delle cellule epiteliali e immunitarie ed è frequentemente studiata in modelli di fibrosi, disfunzione metabolica e segnalazione del microambiente associato ai tumori. Una segnalazione LPAR2/EDG-4 deregolata è stata associata a fenotipi aberranti di proliferazione e motilità, rendendola rilevante per l’analisi delle vie di segnalazione in sistemi cellulari pertinenti alla malattia.

EDG-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LPAR2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EDG-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LPAR2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LPAR2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EDG-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LPAR2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EDG-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EDG-4 nelle cellule tumorali con espressione di LPAR2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.