EDG-1/S1P1/S1PR1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400413-ACT

S1PR1 (EDG-1/S1P1) è un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) responsivo alla sfingosina-1-fosfato (S1P) che integra la segnalazione lipidica extracellulare per regolare l’integrità della barriera endoteliale, la maturazione vascolare e il traffico delle cellule immunitarie. In seguito al legame con il ligando, S1PR1 si accoppia principalmente a Gi per coordinare le vie di segnalazione PI3K–AKT, MAPK/ERK e Rac/Rho (famiglia Rho), che modellano la dinamica del citoscheletro, la stabilità delle giunzioni aderenti e le risposte chemiotattiche. Questo recettore è centrale nell’angiogenesi e nell’egresso dei linfociti, collegando i gradienti di S1P al movimento e al posizionamento coordinati delle cellule tra compartimenti vascolari e linfoidi. Una segnalazione S1PR1 deregolata è stata implicata in reti di segnalazione infiammatoria, disfunzione vascolare e biologia del microambiente tumorale, a supporto del suo impiego in studi meccanicistici su immunità, permeabilità e processi associati alla metastasi.

EDG-1/S1P1/S1PR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di S1PR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EDG-1/S1P1/S1PR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus S1PR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione S1PR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EDG-1/S1P1/S1PR1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus S1PR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EDG-1/S1P1/S1PR1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EDG-1/S1P1/S1PR1 nelle cellule tumorali con espressione di S1PR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.