EBF4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402438-ACT

EBF4 (early B-cell factor 4) codifica un fattore di trascrizione helix–loop–helix della famiglia EBF che si lega al DNA e coordina programmi di espressione genica ristretti a specifiche linee cellulari. Pur essendo meno caratterizzato rispetto ad altri paraloghi EBF, EBF4 è implicato nella regolazione di reti trascrizionali legate alla differenziazione cellulare, al patterning dello sviluppo e al mantenimento dell’identità cellulare tramite l’occupazione di enhancer e promotori. Modellando gli stati di accessibilità della cromatina e gli output trascrizionali, EBF4 può influenzare processi quali il controllo della proliferazione, l’adattamento metabolico e l’espressione genica in risposta allo stress. Una deregolarizzazione dei circuiti trascrizionali della famiglia EBF è stata associata a stati di differenziazione aberranti e a riprogrammazione trascrizionale rilevante per la malattia, rendendo EBF4 un bersaglio utile per studi meccanicistici delle reti di regolazione genica.

EBF4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EBF4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EBF4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EBF4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EBF4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EBF4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EBF4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EBF4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EBF4 nelle cellule tumorali con espressione di EBF4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.