EAAT4 Plasmide KO CRISPR/Cas9 (m): sc-422986

Panoramica

Slc1a6 codifica il trasportatore degli amminoacidi eccitatori 4 (EAAT4), un trasportatore della glutammato ad alta affinità dipendente da Na+ che contribuisce alla rimozione del glutammato extracellulare e limita la segnalazione eccitotossica a livello delle sinapsi. Nel SNC del topo, EAAT4 è particolarmente arricchito nei neuroni di Purkinje del cervelletto e modula la trasmissione sinaptica accoppiando la captazione del glutammato ai gradienti ionici, influenzando così l’eccitabilità neuronale e la plasticità. Attraverso la regolazione della neurotrasmissione glutammatergica, EAAT4 si interfaccia con vie legate all’omeostasi sinaptica, alla segnalazione dipendente dal calcio e alle risposte neuroinfiammatorie innescate dalla deregolazione del glutammato. Una capacità alterata di trasporto del glutammato è rilevante in modelli di disfunzione cerebellare e in fenotipi più ampi associati alla neurodegenerazione, in cui la segnalazione eccitatoria e l’integrità sinaptica risultano compromesse.

Il plasmide CRISPR/Cas9 KO EAAT4 (m) è un pool di plasmidi progettato per la distruzione mirata del gene Slc1a6 in linee cellulari mouse. Ciascun plasmide co-esprime un singolo RNA guida (sgRNA) unico che prende di mira un sito distinto all'interno del Slc1a6 insieme alla nucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes. I plasmidi codificano anche per la GFP, consentendo l'identificazione fluorescente e l'arricchimento delle cellule trasfettate con successo tramite microscopia a fluorescenza o citometria a flusso.

Il design multi-guida aumenta la probabilità di generare inserzioni o delezioni (indels) che interrompono il frame di lettura aperto Slc1a6 a seguito della formazione di rotture a doppio filamento mediate da Cas9. Le rotture del DNA introdotte dal sistema CRISPR/Cas9 vengono riparate attraverso vie endogene di giunzione non omologa (NHEJ), che spesso provocano mutazioni con spostamento del frame che annullano l'espressione della proteina EAAT4.

Questo sistema di knockout CRISPR consente la generazione efficiente di modelli cellulari carenti di Slc1a6 per lo studio della segnalazione di EAAT4, studi di genomica funzionale, ricerca sulla biologia del cancro e valutazione delle risposte terapeutiche in linee cellulari umane.

Caratteristiche principali

• sgRNA mirati agli esoni Slc1a6 critici per la funzione di EAAT4
  Co-espressione di SpCas9 e sgRNA da un singolo plasmide per una somministrazione semplificata
  Reporter GFP per l'identificazione delle cellule trasfettate
  Pool di plasmidi mirati a più siti genomici di Slc1a6 per migliorare l'efficienza del knockout
  Compatibile con la somministrazione tramite trasfezione

Varianti di progettazione

CRISPR +/- HDR

• Gli gRNA codificati dal EAAT4 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m) e dal EAAT4 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m2) prendono di mira siti distinti all'interno del locus Slc1a6. Potrebbe essere disponibile uno o entrambi i design di targeting. Vedere Prodotti correlati per la disponibilità.
  I costrutti donatori HDR codificati dal EAAT4 Plasmide HDR (m) e il plasmide HDR EAAT4 (m2) contengono una cassetta di resistenza alla puromicina e un reporter RFP affiancato da bracci di omologia Slc1a6 per supportare la riparazione diretta dall'omologia in siti bersaglio Slc1a6 definiti corrispondenti ai disegni CRISPR/Cas9 KO. La disponibilità dei donatori HDR può variare. Vedere Prodotti correlati per la disponibilità.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.