E6BP Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-409673-LAC

RCN2 codifica la E6-binding protein (E6BP), una proteina luminale del reticolo endoplasmatico implicata nella regolazione, calcio-dipendente, della via secretoria e nell’omeostasi del RE. Si ritiene che E6BP influenzi il ripiegamento e il traffico delle proteine attraverso processi di controllo qualità associati al RE e possa intersecarsi con la segnalazione di risposta allo stress che modella la proteostasi cellulare. Un’alterata regolazione delle proteine leganti il calcio residenti nel RE, inclusa E6BP, è stata associata a cambiamenti nella secrezione, nella sopravvivenza cellulare sotto stress e in fenotipi rilevanti per la biologia del cancro e altri disturbi che coinvolgono squilibri della proteostasi. RCN2/E6BP umano rappresenta quindi un nodo utile per studiare la funzione del RE, la gestione del calcio e le reti di segnalazione collegate alla secrezione.

Le particelle di attivazione lentivirale E6BP (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di RCN2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale E6BP (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione RCN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di E6BP. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo RCN2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.