E2F-7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401855-ACT

E2F7 codifica E2F-7, un repressore trascrizionale atipico della famiglia E2F che contribuisce a garantire la corretta tempistica del ciclo cellulare limitando l’espressione dei geni responsivi a E2F durante la fase S e partecipando al controllo dei checkpoint. Modulando programmi trascrizionali legati alla replicazione del DNA, alle risposte al danno al DNA e alla proliferazione cellulare, E2F-7 influenza la stabilità del genoma e l’adattamento allo stress. La disregolazione dell’espressione di E2F7 è stata associata a fenotipi proliferativi e a stati di differenziazione alterati, rendendolo rilevante per studi sulla segnalazione oncogenica, sullo stress replicativo e sulla regolazione del destino cellulare. E2F-7 interagisce inoltre con le dinamiche più ampie della rete Rb/E2F che coordinano la progressione attraverso la transizione G1/S e le fasi successive del ciclo cellulare.

E2F-7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di E2F7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

E2F-7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus E2F7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione E2F7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di E2F-7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus E2F7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da E2F-7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via E2F-7 nelle cellule tumorali con espressione di E2F7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.