E2F-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400851-ACT

E2F4 codifica il fattore di trascrizione umano E2F-4, un regolatore chiave dell’espressione genica del ciclo cellulare che in genere agisce insieme alle proteine DP e ai repressori della famiglia RB per controllare la transizione dalla fase G0/G1 alla fase S. E2F-4 partecipa a complessi associati a DREAM e alle pocket proteins, che coordinano la repressione e l’attivazione temporizzata dei geni coinvolti nella replicazione del DNA, nella progressione mitotica e nel controllo dei checkpoint. Attraverso il suo ruolo nella segnalazione proliferativa e nei programmi di differenziamento, un’alterata attività di E2F4 può contribuire a un controllo del ciclo cellulare deregolato, a instabilità genomica e a stati trascrizionali oncogenici. Le reti trascrizionali dipendenti da E2F-4 sono quindi ampiamente studiate in biologia dei tumori, nella senescenza e in contesti di sviluppo in cui l’uscita e il rientro nel ciclo cellulare sono strettamente regolati.

E2F-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di E2F4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

E2F-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus E2F4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione E2F4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di E2F-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus E2F4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da E2F-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via E2F-4 nelle cellule tumorali con espressione di E2F4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.