dystrophin Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-420021-LAC

Il gene Dmd del topo codifica la distrofina, una grande proteina citoscheletrica che collega l’F-actina al complesso distrofina–glicoproteine a livello del sarcolemma, stabilizzando le membrane delle fibre muscolari durante la contrazione e organizzando i costameri. La distrofina sostiene la meccano-trasduzione e l’integrità di membrana, influenzando l’omeostasi del calcio, la segnalazione dell’ossido nitrico e i programmi di rigenerazione muscolare. La perdita o la riduzione della distrofina altera il complesso proteico associato alla distrofina, con conseguente fragilità del sarcolemma, infiammazione e attivazione di vie di rimodellamento ampiamente utilizzate per modellare, nei sistemi murini, la biologia delle distrofie muscolari di Duchenne/Becker. Dmd è quindi centrale negli studi sull’omeostasi del muscolo scheletrico e cardiaco, sulle risposte allo stress e sulla regolazione genica nel muscolo striato.

Le particelle di attivazione lentivirale dystrophin (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Dmd in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale dystrophin (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Dmd, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di dystrophin. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Dmd e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.