DSPP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401195-ACT

La sialofosfoproteina della dentina (DSPP) è un precursore della matrice extracellulare secreta che viene processato proteoliticamente in sialoproteina della dentina e fosfoproteina della dentina, regolatori chiave della mineralizzazione della dentina e della nucleazione dell’idrossiapatite. Negli odontoblasti e in linee mesenchimali craniofacciali correlate, DSPP contribuisce all’organizzazione della matrice, alla gestione del fosfato e ai processi di deposizione minerale che coordinano lo sviluppo del dente e la sua integrità strutturale. Alterazioni dell’espressione o della funzione di DSPP sono associate a difetti ereditari della dentina, ad anomalie dell’interfaccia smalto–dentina e a fenotipi più ampi di mineralizzazione craniofacciale. Poiché DSPP integra la biologia della matrice extracellulare con le vie della biomineralizzazione, rappresenta un utile riferimento molecolare per studiare la differenziazione odontogenica, la maturazione della matrice e la dinamica della deposizione minerale in modelli cellulari umani.

DSPP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DSPP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DSPP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DSPP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DSPP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DSPP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DSPP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DSPP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DSPP nelle cellule tumorali con espressione di DSPP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.