DSCAM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403385-ACT

DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule) codifica un recettore di superficie cellulare della superfamiglia delle immunoglobuline che media il riconoscimento cellula-cellula e la guida dei neuriti, sostenendo l’orientamento degli assoni, l’auto-evitamento dendritico e la connettività sinaptica durante lo sviluppo del sistema nervoso umano. La segnalazione di DSCAM interagisce con il rimodellamento del citoscheletro dipendente dall’adesione e con vie chinasi che influenzano la crescita dei neuriti, incluse la segnalazione della famiglia SRC e la conseguente dinamica dell’actina. Alterazioni del dosaggio o della regolazione di DSCAM sono state associate a fenotipi di neurosviluppo, comprese condizioni legate a variazioni del numero di copie e a squilibri di dosaggio genico correlati alla trisomia. Come modello di specificità di cablaggio dipendente dal contatto, DSCAM è ampiamente studiato nella differenziazione neuronale, nell’assemblaggio dei circuiti e nella biologia dell’adesione cellulare.

DSCAM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DSCAM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DSCAM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DSCAM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DSCAM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DSCAM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DSCAM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DSCAM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DSCAM nelle cellule tumorali con espressione di DSCAM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.